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2024/07/05

第51回日本毒性学会学術年会

新しいハイスループット個別ゼブラフィッシュ腎毒性スクリーニングシステムの創生と応用

野本毅1,2、清水陽嘉1,2、寺見文宏1,2、森葵泉1,2、松岡さおり1,2、櫛田友紀1,2、西野加奈子1,2、○田中利男1,2
1三重大学大学院医学系研究科システムズ薬理学
2三重大学メディカルゼブラフィッシュ研究センター

ゼブラフィッシュは、世界で腎毒性スクリーニングに広範に活用されています。その理由は、ヒト病態ゲノムと８４％の相同性が認められ毒性機構におけるヒトとの類似性が示唆されることや全身の透明性により腎形態学や腎機能を直接解析できることなどによります。さらに、多産系であることや臓器形成スピードが早いことなどin vivo腎毒性ハイスループットスクリーニングへの適合性が最も高い脊椎動物であることが注目されています。当初ゼブラフィッシュ腎毒性スクリーニングは、形態学的観察やクレアチニン、尿素窒素などの血液検査を用いて腎毒性を評価していました。しかし、これらの方法は感度が低く、早期診断には不十分でありました。そこで、１種類の分子量の蛍光ラベルデキストランを静注して、腎毒性蛋白尿定量に応用することになりました。この場合、内因性タンパク質ではないことや分子量が１種類であることからいくつかの課題を残しました。そこで、内因性血漿蛋白質(1/2vdbp-mCherry:50kDa, NL-D3:35.5kDa)のトランスジェニックゼブラフィッシュによる腎毒性蛋白尿定量が、報告されました。しかしながら、これらの場合も１種類の分子量であり、腎毒性における糸球体機能と尿細管機能を識別できないことが課題として残されました。そこで我々は、2013年(ACS Chem Neurosci.4:1183-93)に、ゼブラフィッシュ飼育水に添加することにより速やかに全ての分子量の血漿蛋白質にin vivoで結合する新規蛍光色素ZMB741を独自開発し、圧倒的な優越性を持つ非侵襲性ゼブラフィッシュ個別in vivo腎毒性蛋白尿定量プロトコルを構築しました。その結果、腎毒性の糸球体障害と尿再細管障害を識別できる全く新しい原理によるin vivoハイスループット腎毒性スクリーニングシステムを創生しましたので、報告します。

Zebrafish have been extensively used for nephrotoxicity screening worldwide, because of their 84% homology to the human pathological genome, which suggests similarity to humans in toxicity mechanisms, and their whole-body transparency, which allows direct analysis of renal morphology and renal function. In addition, zebrafish is the most suitable vertebrate for in vivo nephrotoxicity high-throughput screening due to its high fecundity and rapid organogenesis. However, conventional methods were not sensitive enough for early diagnosis. Therefore, it was decided to apply intravenous fluorescent labeled dextran of one molecular weight for nephrotoxic proteinuria quantification. But it is not an endogenous protein and has only one molecular weight. Therefore, the determination of nephrotoxic proteinuria by transgenic zebrafish of plasma proteins (1/2vdbp-mCherry:50kDa, NL-D3:35.5kDa) was reported. However, in these cases, the molecular weight was still one of a kind, and the inability to discriminate between glomerular and tubular functions in nephrotoxicity remained an issue. Therefore, in 2013 (ACS Chem Neurosci. 4:1183-93), we independently developed a novel fluorescent dye ZMB741 that rapidly binds to all molecular weight plasma proteins in vivo. We have established a protocol for in vivo quantification of nephrotoxic proteinuria in individual zebrafish. As a result, we report the creation of an in vivo high-throughput nephrotoxicity screening system based on a completely new principle that can discriminate between glomerular and tubular function in nephrotoxicity.